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Résumé de Thèse ayant obtenu le PRIX GREMI 2006 :

 

RÔLE DE LA PROTEINASE 3 DANS L’APOPTOSE ET L’ACTIVITE
PRO-INFLAMMATOIRE DU NEUTROPHILE :

ACTIVATION COMPARTIMENTEE DE LA PRO-CASPASE-3,
EN ABSENCE D’APOPTOSE

Magali Pederzoli-Ribeil

 

Ce travail a été réalisé dans l'Unité INSERM 845 (ex-507), à l'Hôpital Necker à Paris,
sous la direction de Véronique Witko-Sarsat

 

Le neutrophile est une cellule majeure de l’ immunité innée qui participe aux mécanismes de défense de l’organisme dans la lutte contre l’agent infectieux. A chaque étape de sa différenciation, il a acquis successivement différents types de granules, que sont les granules azurophiles, spécifiques, gélatinase, puis dans le neutrophile mature, les vésicules de sécrétion. Il existe un dogme selon lequel une protéine exprimée dans un certain type de granule, a été synthétisée uniquement à un certain stade de la différenciation : c'est la théorie du " targeting by timing ". La différenciation du neutrophile se traduit donc par une compartimentalisation très stricte, chaque type de granule contenant des protéines particulières, qui sont spécialisées dans ses fonctions effectrices. Au cours de son activation, le neutrophile va mobiliser successivement et de façon contrôlée, ses différents types de granules spécialisées dans un type de réponse du neutrophile. De façon très surprenante, la protéinase 3 (PR3), qui appartient à la famille des homologues des sérines protéases du neutrophile, n’obéit pas à ce dogme, puisqu’elle est, non seulement majoritairement exprimée dans les granules azurophiles, mais aussi dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique du neutrophile . D’un point de vue physiopathologique, la PR3 a la particularité d’être la cible d’auto-anticorps, les ANCA (« Anti Neutrophil Cytoplasmic Antibody »), dans une vascularite systémique, la granulomatose de Wegener . Il est important de noter qu’une forte proportion de neutrophiles exprimant la PR3 membranaire constitue un facteur de risque pour les maladies inflammatoires et en particulier les vascularites et la polyarthrite rhumatoïde.

 

Puisque la PR3 ne suit pas le dogme de compartimentation du neutrophile, mon projet de Thèse s’est focalisé sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de la PR3 et en particulier l’identification de nouvelles cibles . Ceci à travers l’étude particulière du clivage de la procaspase-3, par la PR3, en comparaison avec l’élastase, sérine protéase homologue de la PR3, qui est strictement et uniquement localisée dans les granules azurophiles et ne partage pas la localisation extragranulaire de la PR3 dans le neutrophile.

 

Ce travail ne pouvait être réalisé dans le neutrophile mature, cellule en fin de différenciation possèdant un faible taux de synthèse protéique et une durée de vie de quelques heures. De plus, la PR3 possédant une spécificité de substrat très proche de celle de l’élastase, il était impossible d'inhiber de manière spécifique soit la PR3, soit l'élastase et aucun substrat spécifique de l'une ou de l'autre de ces protéases n'était disponible quand nous avons entrepris cette étude. Dans le laboratoire, nous avons donc choisi la stratégie consistant à exprimer de façon stable la PR3 ou l'élastase dans un modèle cellulaire particulier qui n'exprime de manière endogène ni la PR3, ni l'élastase mais qui possède tout l'équipement enzymatique indispensable à la synthèse, la maturation, l'adressage et au stockage de ces protéases. Nous avons donc transfecté des cellules mastocytaires humaines (HMC1) et de rat (RBL), avec l'ADNc de la PR3 et de l'élastase. Nous avons également établi une lignée surexprimant la PR3 rendue inactive par la mutation de la sérine représentant le troisième acide amine de la triade catalytique. Ces cellules surexprimant la PR3 apparaissent comme un bon modèle d'étude structurale et fonctionnelle de la PR3 et peuvent dans une certaine mesure être considérées comme un modèle pertinent du neutrophile.

 

-Dans la première partie de mon travail, l’étude de la localisation de la PR3 et de l’élastase dans un modèle de transfectants stables (RBL) exprimant soit la PR3, soit l’élastase, nous a permis de mettre en évidence un pool extra-granulaire de PR3 mobilisé au cours de l’apoptose, à la surface cellulaire, en absence de dégranulation. De plus, cette externalisation de PR3 était étroitement liée à la l'externalisation de la phosphatidylsérine. Dans les mêmes conditions expérimentales, l’élastase n’était pas externalisée de manière concomitante à la phosphatidylsérine (1). Ce travail s’est poursuivi par la recherche de partenaires de la PR3 associée à la membrane plasmique, en relation avec les protéines impliquées dans le flip-flop membranaire de l’apoptose. Nous avons décrit la phospholipide scramblase 1 (PLSCR1) comme partenaire membranaire de la PR3 qui participe à son externalisation à la membrane des cellules apoptotiques. Nous avons également démontré que cette PR3 externalisée interférait avec les mécanismes de reconnaissance des signaux « eat-me » et de phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages (2).

 

-Dans la seconde partie de mon travail, nous nous sommes intéressés à l’apoptose, phénomène clef de la résolution de l’inflammation, dans notre modèle de transfectants mastocytaires (RBL et HMC1). Nous avons mesuré une forte activité caspase-3 constitutive dans les cellules transfectées avec la PR3 , due au clivage direct de la procaspase-3 par la PR3. Cette activation et ce clivage de la procaspase-3 en un fragment actif de 22 kDa , différent du fragment apoptotique de 17 kDa, avaient lieu en absence d’apoptose dans le compartiment membranaire . Le fragment de 22 kDa de la caspase-3 était retrouvé dans le neutrophile mature où il apparaissait relié à la survie cellulaire puisqu’il disparaissait après induction de l’apoptose. Après traitement des cellules avec le péfabloc, inhibiteur de sérines protéases, le fragment de 22 kDa disparaissait. De plus, nous avons mis en évidence, après perméabilisation des neutrophiles avec la streptolysine-O, une co-localisation extra-granulaire de la PR3 et de la caspase-3 (3). Tous ces résultats suggèrent l’implication d’une sérine protéase dans le clivage de la procaspase-3 dans le neutrophile, la PR3 apparaissant la plus probable, compte tenu de nos données obtenues dans nos transfectants. Nous avons donc décrit la procaspase-3 comme nouvelle cible membranaire de la PR3 et non de l`élastase. Paradoxalement, nous avons mis en évidence que ce clivage en fragment actif de 22 kDa, est relié a la survie cellulaire et non a l'apoptose, ce qui suggère que ce phénomène de séquestration de la caspase-3 activée dans le compartiment membranaire inhiberait l`apoptose. En effet, ce phénomène pourrait participer au retard d’apoptose observé dans les neutrophiles isolés du site inflammatoire de patients atteints de maladies inflammatoires chroniques, comme la polyarthrite rhumatoïde.

En conclusion, nous avons démontré que la PR3, de par sa localisation subcellulaire particulière non partagée par ses homologues, possède des cibles (la procaspase-3 et la p21(4)) et des fonctions qui pourraient intervenir dans la modulation de l'activité et de la survie du neutrophile. La PR3 ne peut donc plus être considérée comme une simple protéase libérée au cours de l’activation du neutrophile et dégradant de manière plus ou moins spécifique les protéines de la matrice extracellulaire, mais bel et bien comme une protéine capable de réguler l’inflammation et dont le rôle biologique dépend de sa localisation subcellulaire. Mes travaux ont donc permis d'éclairer certaines facettes encore mystérieuses de la PR3. Sous l'apparence d'une simple homologue de serine protéase, strictement compartimentée dans des granules comme tant de protéases, la PR3 nous déroute par ses aspects biochimiques, par son adressage défiant toute réglementation et finalement, par la variété de ses cibles, offrant tout un spectre potentiel d'activités biologiques. Enfin, de façon plus générale, l'analyse moléculaire et fonctionnelle de la PR3 s'intègre dans l'étude des mécanismes moléculaires effecteurs du neutrophile, véritable cellule effectrice de la réaction inflammatoire. Ainsi, le concept de cellule en phase terminale de différenciation et a courte durée de vie n’ayant pas de capacité immunomodulatrice, doit être révisé. En conclusion, une meilleure compréhension des mécanismes pro-inflammatoires et des processus modulant l’apoptose du neutrophile est essentielle pour envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques qui favoriseraient l’élimination du neutrophile dans des maladies inflammatoires chroniques.

 

Magali Pederzoli a bénéficié d’une bourse de Thèse de l’Association pour la Recherche sur la Polyarthrite rhumatoïde (ARP) et d’une bourse de soudure de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM).



Bibliographie

1-Durant S, Pederzoli M, Lepelletier Y, Canteloup S, Nusbaum P, Lesavre P, Witko-Sarsat V. Apoptosis-induced proteinase 3 membrane expression is independent from degranulation. J Leukoc Biol. 2004;75: 87-98.

2- Kantari C*, Pederzoli-Ribeil M*, Amir-Moazami O, Cruz Moura I, Lecomte MC, Benhamou M, and Witko-Sarsat V. Proteinase 3, the Wegener autoantigen, is externalized during neutrophil apoptosis: evidence for a functional association with phospholipid scramblase 1 and interference with macrophage phagocytosis.

* these two authors equally contributed to the work (Submitted for publication)

3- Pederzoli M, Kantari C, Gausson V, Moriceau S, Witko-Sarsat V. Proteinase-3 induces procaspase-3 activation in the absence of apoptosis: potential role of this compartmentalized activation of membrane-associated procaspase- 3 in neutrophils. J Immunol. 2005;174: 6381-90.

4-Dublet B, Ruello A, Pederzoli M, Hajjar E, Courbebaisse M, Canteloup S, Reuter N, Witko-Sarsat V. Cleavage of p21/WAF1/CIP1 by proteinase 3 modulates differentiation of a monocytic cell line. Molecular analysis of the cleavage site. J Biol Chem. 2005; 280: 30242-53.

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