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Résumé de la Thèse ayant obtenu le PRIX GREMI 2008 :

Caractérisation des ligands de C1q impliqués dans la reconnaissance des cellules apoptotiques

Helena Païdassi

Ce travail a été réalisé dans le laboratoire d’enzymologie moléculaire de l’Institut de Biologie Structurale (UMR 5075) à Grenoble, sous la direction de Philippe Frachet

L’apoptose est une forme physiologique de mort cellulaire programmée. Au cours de l’apoptose, les cellules apoptotiques acquièrent de nouveaux déterminants de surface (appelés signaux « eat-me »). La reconnaissance spécifique de ces signaux « eat-me » par les cellules phagocytaires permet d’une part l’élimination rapide et efficace des corps apoptotiques et d’autre part l’induction d’une réponse immunitaire adaptée. Ceci permet in fine de prévenir le développement d’une réaction inflammatoire inappropriée et de maintenir la tolérance au soi (1).
Les études de ces dernières années sur les mécanismes de reconnaissance et d’élimination des cellules apoptotiques ont permis de mettre en évidence que C1q, élément de reconnaissance de la voie classique du complément est impliqué dans ce processus. Ainsi les personnes déficientes en C1q développent une maladie auto-immune inflammatoire, le lupus, associé à un défaut d’élimination des cellules apoptotiques.

C1q est un hexamère d’hétérotrimères qui comporte deux régions caractéristiques, une partie de type collagène (CLF, « collagenous-like fragment ») de laquelle émergent six régions globulaires (GR, « globular region »). Il a été mis en évidence de façon indirecte que ce sont ces GR qui sont mises en jeu dans la reconnaissance spécifique des cellules apoptotiques, les CLF étant eux impliqués pour la reconnaissance de C1q à la surface des phagocytes (2) . Lorsque j’ai commencé ma thèse, les récepteurs phagocytaires de C1q avaient été décrits, cependant aucun des motifs reconnus par C1q à la surface des cellules apoptotiques n’était connu. Mon projet de thèse a donc consisté à identifier et à caractériser les ligands exposés à la surface cellulaire au cours de l’apoptose, alors responsables de la fixation des GR et donc de la reconnaissance spécifique des cellules apoptotiques par C1q.


Rôle de C1q dans la reconnaissance des cellules apoptotiques


Principe général du test cellulaire au BIAcore

Pour cette étude, j’ai dans un premier temps développé un test cellulaire au BIAcore permettant de suivre en temps réel et sans marquage préalable les interactions entre la surface cellulaire et C1q (3). Ce test nous a permis de nous affranchir des contraintes imposées par notre modèle et de démontrer que les GR de C1q se fixent à la membrane des cellules rapidement après l’induction de l’apoptose. C’est également à l’aide de ce test que nous avons pu démontrer l’implication de différentes molécules exposées à la membrane cellulaire au cours de l’apoptose et responsables de la reconnaissance spécifique des cellules apoptotiques par C1q.

Le premier objectif de ce travail était de déterminer si l’un des signaux « eat-me » déjà décrits dans la littérature pouvait être responsable de la reconnaissance spécifique des cellules apoptotiques par C1q.

• Le premier ligand potentiel auquel je me suis intéressée est la phosphatidylsérine (PS), marqueur canonique de l’apoptose et le signal « eat-me » le mieux caractérisé. Par cytométrie en flux, nous avons montré que l’exposition très précoce de la PS a lieu de façon concomitante avec la fixation des GR de C1q à la surface des cellules apoptotiques. L’étude de cette interaction in vitro nous a permis de montrer pour la première fois que C1q, via ses GR, interagit de façon spécifique et avec une très forte affinité avec la PS. Ces résultats ont été complétés par des études cristallographiques réalisées en collaboration avec le laboratoire de cristallographie et de cristallogenèse des protéines de l’IBS qui ont permis de montrer que d’après le modèle structural de C1q, cette interaction est compatible avec une reconnaissance de la PS sur la surface de la cellule cible. Enfin, des expériences d’inhibition à l’aide du test cellulaire développé au BIAcore ont permis de montrer l’implication de cette interaction au niveau cellulaire. L’ensemble de ces résultats obtenus par une approche multidisciplinaire a permis d’identifier pour la première fois un motif reconnu par C1q à la surface des cellules apoptotiques (3).


Structure cristallographique du complexe phosphosérine-GR

• La deuxième piste de recherche nous a été dictée par des travaux réalisés au laboratoire montrant que C1q a la capacité de reconnaître des glycoconjugués immobilisés et que cette activité de type « lectine » peut être inhibée très efficacement par le désoxy-D-ribose. Or l’ADN a justement été caractérisé comme un signal « eat-me » exposé de façon précoce à la surface des cellules apoptotiques (4) . La même stratégie expérimentale que pour l’étude de l’implication de la PS a été utilisée pour déterminer si l’ADN était reconnu par C1q à la surface des cellules apoptotiques. Des expériences d’inhibition à l’aide du test cellulaire BIAcore nous a ainsi permis de montrer que l’ADN est également un motif reconnu par C1q de façon spécifique à la surface des cellules apoptotiques (5).

Le second objectif de mes travaux a été de déterminer si les partenaires et/ou récepteurs connus de C1q pouvaient être des ligands à la surface des cellules apoptotiques. La calréticuline (CRT) a été récemment impliquée dans la reconnaissance des cellules apoptotiques comme un signal « eat-me » à la surface des cellules apoptotiques (6). Hors, s’il est admis que la CRT est capable de reconnaître les CLF de C1q et que cette interaction est mise en jeu à la surface des cellules phagocytaires, les études publiées concernant ses capacités d’interaction avec les GR sont contradictoires. A l’aide du BIAcore, nous avons pu montrer de façon certaine que les GR interagissent également avec la CRT et ce avec une forte affinité. Ce résultat permet d’émettre l’hypothèse que C1q reconnaît la CRT exposée à la surface des cellules apoptotiques. Cela a été conforté par des expériences de microscopie confocale qui ont montré que la CRT s’accumule à la surface des cellules au cours de l’apoptose et que les sites d’exposition de la CRT sont co-localisés avec ceux où se fixent les GR. L’étude de la pertinence «  physiologique » de cette interaction est actuellement en cours (7).

En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d’identifier au moins deux ligands de C1q à la surface des cellules apoptotiques, la phosphatidylsérine et l’ADN, et également de dégager une autre piste prometteuse, la calréticuline. Ainsi, de par son caractère hétérotrimérique et multivalent, C1q a la capacité unique de collecter plusieurs signaux de reconnaissance qui, pris ensemble, fourniraient un signal fort de reconnaissance.
A terme cette étude devrait permettre non seulement de préciser les mécanismes impliqués dans le développement des maladies auto-immunes, mais également d’envisager l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques capables sinon de prévenir, du moins de diminuer l’inflammation dans certaines pathologies inflammatoires auto-immunes telles le lupus.

 

Helena Païdassi a bénéficié d’un Contrat de Formation par la Recherche du CEA de Grenoble ainsi que d’un poste d’ATER de l’Université Joseph Fourier (Grenoble I).

Bibliographie :

  • Païdassi H., Tacnet-Delorme P., Arlaud GJ., and Frachet P. 2009. How phagocyte track down and respond to apoptotic cells. Crit Rev Immunol. On press
  • Navratil JS., Watkins SC., Wisnieski JJ., and Ahearn JM. 2001. The globular heads of C1q specifically recognize surface blebs of apoptotic vascular endothelial cells. J Immunol 166:3231-3239
  • Païdassi H., Tacnet-Delorme P., Garlatti V., Darnault C., Ghebrehiwet B., Gaboriaud C., Arlaud GJ., and Frachet P. 2008. C1q binds phosphatidylserine and likely acts as a multiligand-bridging molecule in apoptotic cell recognition. J Immunol 180:2329-2338
  • Elward K., Griffiths M., Mizuno M., Harris CL., Neal JW., Morgan BP., and Gasque P. 2005. CD46 plays a key role in tailoring innate immune recognition of apoptotic and necrotic cells. JBC. 280:36342-36354
  • Païdassi H., Tacnet-Delorme P., Arlaud GJ., Thielens N., and Frachet P. 2008. The lectin-like activity of human C1q and its implication in DNA and apoptotic cell recognition. FEBS letters 582 ( 20): 3111-6
  • Gardai SJ., McPhillips KA., Frasch SC., Janssen WJ., Starefeldt A., Murphy-Ullrich JE., Bratton DL., Oldenborg PA., Michalak M., and Henson PM. 2005. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell 123:321-334
  • Païdassi H, Tacnet-Delorme P, Houen G, Arlaud GJ and Frachet P. Article en préparation sur le rôle de la calréticuline dans la reconnaissance des cellules apoptotiques par C1q


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